试管婴儿问世为人类生殖自我调控树立了新的里程碑。二十多年来，人类生殖助孕技术（assisted re-productive technique，ART）不断发展。20世纪80年代试管婴儿技术主要以解决女性不育为主，以Edwards和Steptoe首创的常规体外受精与胚胎移植（in vitro ertilization and embryo transfer，IVF?ET），列为第1代试管婴儿技术。1992年，Palermo首先使用单精子卵胞浆注射（intracytoplas mic sperm injection，ICSI）治疗男性不育，并且技术难度更高，因而被称为第2代试管婴儿技术。随着近年来分子生物学技术的进步，使单细胞水平进行人类基因诊断成为可能，在生殖助孕的显微操作基础上结合现代分子生物学，发展为人类胚胎植入前遗传学诊断preimplantation genetic diagnosis，PGD）的优生生殖助孕技术，这是今天所谓的第3代试管婴儿技术。当然，生殖助孕相关领域技术，随着核移植技术不断发展，将利用核移植技术进行配子重构，不久的将来有可能成为人类生殖医学应用的新突破。至少，在现阶段人们通过改进超排卵方案、提高卵子质量、发展实验室培养系统、开拓分子生物学技术等方面，来达到提高妊娠率，降低多胎率，减少并发症，出生健康婴儿的最终目的。 1 超排卵方案面临的挑战20世纪90年代初期，常规使用促性腺激素释放激素激动剂（gonadotrophine-releasing hormone ago-nist，GnRH-a）联合促性腺激素（Gn）超排卵。对早发黄体生成素（LH）峰起到良好的抑制作用，避免过早黄素化，改善卵泡发育的同步，提高卵子质量。但是GnRH-a并不能阻止卵巢过度刺激症（ovarian hy-perstimulation syndrome，OHSS）的发生。基于卵泡期高LH水平对卵子有不良影响，20世纪90年代后半期超排卵药物趋向于应用高纯度促卵泡生成素（FSH）（<0.1%LH）及rcc-FSH（不含LH）。高纯度意味含较低有害物质和较高生物活性。若干研究表明使用rcc-FSH的超排卵效率和安全性与HMG、FSH、HP-FSH之间差异无显著性。近来有人提出要区分过多的LH产生的副作用与适量LH产生的生理作用。LH半衰期远较FSH短，HMG注射不导 基金项目:云南省教育厅科研基金项目（编号:03Y632C）致LH升高。适量的LH可使成熟卵子数、胚胎种植率升高，而生化妊娠及早期流产率明显降低。故对ART中正常内分泌功能的患者过度降低LH水平，可能产生不良的结局。新一代的GnRH拮抗剂，可竞争性结合阻断垂体的GnRH受体，效应产生迅速，其去垂体效应与安全性与激动剂无差别，其应用方案有“Single dose”和“Multiple dose”2种。临床研究表明。与激动剂相比，其使用Gn天数、剂量、获卵数、成熟卵子数、移植胚胎数要少。但停药，垂体功能迅速恢复，不需黄体支持。适用于Gn过度反应和正常反应者，降低OHSS发生，但不适用于Gn反应者。

　　2 ICSI是否取代常规IVF

　　ICSI最初应用于严重男性不育，由于ICSI受精率比常规IVF高，其应用范围逐渐扩大，包括既往常规IVF受精失败，不明原因不育，甚至对于年龄大于38岁的妇女，但Bhattachrya近期报道对非男性因素的治疗却没有优越性。一些前瞻性研究认为，畸形子仍然以常规IVF为首选的治疗方法。对常规IVF受精失败再次ICSI（Late ICSI）受精治疗，最终妊娠率低至极微，几乎等于零。其原因在于卵子老化或与种植窗不同步，目前大多数中心已放弃使用。昔日1995年Fishel首次报道圆形精细胞卵浆内注射（ROSI）受精获得妊娠成功，曾风行一时，但由于确认精细胞困难以及未成熟精子受精可能带来的基因缺陷难以估计，热度逐日下降。ICSI的安全性仍然受关注，因为非阻塞性无精症的染色体异常率高;另外，有推测睾丸精子在受精时染色体印迹并未完全结束，因此可能对受精和胚胎早期发育影响不大，但可能导致出生后的异常。比利时Brussels追踪调查了229个经ICSI和133个常规IVF出生的2岁幼儿，并未发现ICSI的幼儿有智力发育慢的特点，但ICSI的性染色非整倍体率和结构异常率有轻微的增高。 #p#分页标题#e#

　　3 PGD比最初设想的更为复杂

　　PGD作为产前诊断的一种形式，为不愿意接受终止妊娠的遗传病高危夫妇提供了选择手段。PGD通常是指从获得的卵母细胞取极体或体外受精的胚胎取部分细胞进行检测，将诊断无遗传病的胚胎移植入子宫，从而防止遗传病患儿的妊娠。首次报道PGD妊娠成功是在1990年分别由andvside和Ver-linsky所在的中心，今天已有分布17个国家的40多个中心建立了PGD技术，大约已进行了2000个PGD临床治疗周期，接近500例妊娠，已有超过400个健康婴儿出生。在过去10年里，PGD的进展较慢，PGD比最初设想的更为复杂，因为萤光原位杂交技术（FISH）的应用使人们逐渐发现在人类的胚胎中存在高比例的染色体嵌合型，因此单个卵裂球是否能代表整个胚胎已开始令人质疑。由于染色体嵌合型的等位基因脱扣（allele drop out，ADO）等问题，诊断的准确率难以达到100%。另外尽管曾多数PGD的患者都有生育能力，但PGD的每个周期出生率与常规相近，而且PGD的费用也较高。但对自身不孕和反复流产的患者而言，PGD仍不失为一种值得尝试的方法。

　　4 囊胚培养是辅助生育技术的研究热点

　　在人类生殖助孕领域中，最受人们关注的是低出生率和高多胎妊娠率。如何在不降低妊娠率的同时减低多胎妊娠率是生殖助孕研究的热点之一。而在囊胚期移植有活力的胚胎即可解决这一问题。因为囊胚与子宫内发育同步，符合种植的生理要求。另外囊胚跨越了胚胎基因激活的阶段，有利于挑选最有活力的胚胎，因此囊胚的种植率高。但在过去的20年里，由于培养环境的限制，囊胚的形成率和种植潜能较低，因此常规一直是在胚胎早期卵裂期（第2天或第3天）移植胚胎以避免不良环境对胚胎的影响。曾有中心使用共同培养来获得可接受的囊胚率（40%～50%）。虽然有报道共同培养的囊胚种植率明显提高，但共同培养难以普遍开展。近年来，序贯培养的方法有取代共同培养的趋势。序贯培养液是根据胚胎不同发育阶段的需求而设计的。如G 1 含有与输卵管液浓度相同的碳水化合物以及早期分裂胚胎需要的非必需氨基酸、谷氨酰胺和ED-TA，因此适合于8细胞期以内的胚胎培养。G 2 的碳水化合物含量与子宫的含量相同，另外G 2 同时含有必须和非必须氨基酸，而没有影响囊胚形成的ED-TA。由于序贯培养满足了胚胎的生理需求和营养物质的供应，因此序贯培养的囊胚更有活力，种植的潜能高。1999年Gardner报道在第3天≥3个8细胞期的胚胎的治疗周期中，选用序贯培养法的囊胚种植率为40%，而妊娠率达65%。但在反复失败的患者中，囊胚培养应用价值似乎不大。Levitas在2001年的ESHR会议上报道对50例反复IVF失败的患者进行囊胚培养和第3天移植的前瞻性随机研 究中，囊胚的种植率明显提高，达40.7%，移植1个囊胚相当于移植3个48～72h的胚胎，但每次取卵的妊娠率分别为22.5%和22.2%，差异无显著性，P>0.05。

　　5 卵子和卵巢组织冷冻的新突破

　　卵子和卵巢组织的冷冻使长期保存生殖细胞或组织成为可能。它不但可以保存IVF中的剩余卵子，还能为癌症患者在化疗前保留部分生殖细胞或组织供化疗后使用。另外，它还可用于赠卵的治疗周期。但卵子对低温非常敏感，经冷冻后卵子发生不同程度的细胞破坏，如细胞骨架的紊乱、染色体的异常和纺锤体的不完整。1999年的Cha在ASRM/CFAS会议上报道用含高浓度的冷冻保护液和极快速的玻璃化冷冻的人类卵子解冻后83%的GV形态正常，68%的培养后成熟，受精率为68%，但移植后无成功妊娠。但用同样方法冷冻的成熟卵子中，77%形态正常，51%能正常受精，19个受精胚中有16个发育至2～8细胞期，经移植给4例病患者后获得2例妊娠。卵巢组织的冷冻也取得一定的进展。将复苏的人胎儿的卵巢移植到免疫抑制的小鼠体内可发育至次级卵泡和窦卵泡，因此卵子和卵巢组织的冷冻有一定的应用价值，值得进一步的研究。 #p#分页标题#e#

　　6 原核评分评估胚胎发育潜能有参考价值
　　
　　通过囊胚培养可以达到减少多胎妊娠的目的，但囊胚培养仅适用于第3天有一定数量的高质量胚胎的患者，而且体外培养时间的延长可能对胚胎也有一定的负面影响，囊胚的冷冻和复苏还需进一步研究。因此，近年来有学者提出可从原核评分来大致评估胚胎的潜能，增加第3天选择胚胎形态的参数。目前有2种原核分类的方法，分别强调2个原核核仁前体发育的快慢和同步化。1999年Tesarik将原核分为6种类型，其中O型的胚胎发育停滞率为8.5%，种植率为100%，而其他5种类型的原核发育停滞为20%～31%。当有至少1个O型的胚胎移植的周期中，妊娠率为50%，而没有O型胚胎的移植周期的妊娠率仅为9%。1998年Scott对97个周期的原核进行原核评分，根据分数的高低选择原核移植，当原核评分>15时，种植率为28%，分娩率为65%。因此，原核期对胚胎进行质量的评估有一定的参考价值。

　　7 核移植技术在生殖助孕领域中应用可能性年龄相关的卵子非整倍体增加是导致高龄不孕妇女胚胎种植率下降的一个重要原因。使用年轻供卵者的卵子获得妊娠率的明显提高。虽然卵子赠送为这部分妇女解决生育问题，但不是完满的结局，因为这些妇女只是孩子的生物学母亲，而不是遗传学意义的母亲。近年来核移植技术的发展为卵子重建提供了一些新的解决办法。其一是进行生殖泡期核移植，即将生殖泡从高龄妇女不成熟卵子中分离出来并与去除生殖泡的年轻妇女的卵浆进行融合，重建后的卵子再经过体外成熟用ICSI授精发育成胚胎。由于这一过程在生殖泡破裂之前进行，因而对于年龄相关的非整倍体率增高导致的不孕尤其适用。然而由于高龄妇女获卵较少，实际操作中能够用于生殖泡核移植的卵子并不多，对于卵巢早衰或卵巢反应性低的患者其应用体细胞核移植技术在哺乳动物克隆中的成功应用，已有人考虑用体细胞核移植技术以获得大量重构卵子。其理论依据是生殖泡期小鼠卵浆具有诱导分裂期生殖细胞或已分化体细胞发生类减数分裂形成单倍体的能力。虽然这一做法的过程类似于动物克隆，但由于通过核移植获得的是卵子而不是胚胎，因而从本质上看与克隆是完全不同的。如果这一想法得到实现，则在可能为卵巢功能低的高龄不孕妇女提供足够的卵子。不过在将这一技术应用于人类之前还有大量的工作值得探讨。（1）哺乳动物细胞核移植的成功引起人们对克隆人的担心，现在已有许多国家明文规定不许将核移植技术应用于人类;（2）无论采用胚胎细胞或体细胞进行动物克隆都需要进行核的重排，目前进行哺乳动物体细胞克隆的细胞来源多限于卵丘细胞、乳腺上皮细胞等生殖系统细胞，其他体细胞的核是否也具有被完全重排的能力尚有待进一步研究;（3）最近的研究表明克隆羊Dolly可能存在早衰现象，从体细胞核移植得来的卵子发育成的个体是否也会出现这种情况尚不得而知;（4）哺乳动物克隆过程中胚胎及胎儿死亡率高的问题已引起人们的高度重视。虽然核移植技术为生殖助孕技术描绘了非常美好的前景，但在这些影响胚胎发育安全性的因素彻底阐明之前尚不适宜于将其应用于人类。

　　8 人类胚胎干细胞将有广阔的医学应用前景

胚胎干细胞是从早期发育的胚胎分离的具有高度未分化的细胞，具有在一定条件下向包括3个胚层（内、中和外胚层）分化的全能性，易于进行基因操作，因此可以成为联系细胞与个体之间的桥梁。1981年获得鼠胚的胚胎干细胞，随后获得羊、猪的胚胎干细胞，1998年Wisconsin大学首次获得了人的传32代的胚胎干细胞，由于胚胎干细胞所具有的重要的科学价值，1991年被评为美国十大科技新闻之一，同年美国国家健康研究所（NIH）解除对人胚胎干细胞研究的禁令，最近英国又解除禁令，在世界上掀起了对人胚胎干细胞研究的热潮。人类胚胎干细胞应用于生物技术的科学价值在于它将改变基因改造的速度和改变物种改造的速度。人类胚胎干细胞的研究具有广阔的应用前景，胚胎干细胞的研究将对人类早期胚胎的发育的认识起重要的作用;胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞将为成千上万患者提供可移植的器官。 #p#分页标题#e#

　　总而言之，近年来生殖医学现状与趋势，表明人类对生殖自我调控更有可能得到实现。

来源：上海协和医院